Dia 2

Olá,

Hoje concluimos a extracção pelo método de fenol-clorofórmio.

Soluções utilizadas:

- NaCl 5M
Para ajudar a precipitar o DNA


- Fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) / Clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)
Desnaturam e removem as proteínas

Formam-se 2 camadas, contendo o DNA na superior e na inferior as proteínas
Extrai-se apenas a camada que contém DNA

Nota: esta parte do processo desenvolveu-se na câmara de fluxo laminar (vertical) por motivos de segurança

- Etanol 96%
Precipita o DNA

Recorreu-se à centrifugação, a um repouso a -20ºC e à incubação a 37ºC




- QUANTIFICAÇÃO

Este processo permite-nos determinar a quantidade de DNA, RNA e proteínas presentes na amostra. É importante que haja uma grande quantidade de DNA para seguir para o PCR e pouca quantidade de RNA e proteínas para que não interfiram no processo de amplificação.

Quant-iT Assay Kit é o nome do kit utilizado para realizar este processo(http://www.probes.invitrogen.com/handbook/sections/0803.html)

Aparelho utilizado para quantificação

Resultados

Método de Chelex

- DNA suficiente

- pouca quantidade de RNA e proteínas

Pronto para PCR

Método de Fenol

- Pouca quantidade de DNA

- pouca quantidade de RNA e proteínas

Apesar de conter pouco DNA, as quantidades de RNA e proteínas são inferiores à de DNA, estando, assim, pronto para PCR.

Fiquem atentos ao próximo post...