Dia 2

Olá,

Hoje concluimos a extracção pelo método de fenol-clorofórmio.

Soluções utilizadas:

- NaCl 5M
Para ajudar a precipitar o DNA


- Fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) / Clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)
Desnaturam e removem as proteínas

Formam-se 2 camadas, contendo o DNA na superior e na inferior as proteínas
Extrai-se apenas a camada que contém DNA

Nota: esta parte do processo desenvolveu-se na câmara de fluxo laminar (vertical) por motivos de segurança

- Etanol 96%
Precipita o DNA

Recorreu-se à centrifugação, a um repouso a -20ºC e à incubação a 37ºC




- QUANTIFICAÇÃO

Este processo permite-nos determinar a quantidade de DNA, RNA e proteínas presentes na amostra. É importante que haja uma grande quantidade de DNA para seguir para o PCR e pouca quantidade de RNA e proteínas para que não interfiram no processo de amplificação.

Quant-iT Assay Kit é o nome do kit utilizado para realizar este processo(http://www.probes.invitrogen.com/handbook/sections/0803.html)

Aparelho utilizado para quantificação

Resultados

Método de Chelex

- DNA suficiente

- pouca quantidade de RNA e proteínas

Pronto para PCR

Método de Fenol

- Pouca quantidade de DNA

- pouca quantidade de RNA e proteínas

Apesar de conter pouco DNA, as quantidades de RNA e proteínas são inferiores à de DNA, estando, assim, pronto para PCR.

Fiquem atentos ao próximo post...

Dia 1

Olá,

Hoje começámos por fazer uma pesquisa sobre as diferentes formas de analisar os vestigios humanos nas amostras recolhidas, nomeadamente saliva e sangue.

Relativamente à análise das calças manchadas, foi necessário determinar, previamente, se as manchas eram de sangue ou não. Para tal, utilizámos o Bluestar Forensic Kit (http://www.bluestar-forensic.com/index.php) que revela a presença de sangue porque reage com o ferro presente na hemoglobina, produzindo uma luz azul apenas visível em ambientes escuros (luz quimiluminescente).

Após a confirmação da existência de sangue, procedemos à análise que nos permite determinar se o sangue é humano ou animal - Hexagon OBTI (http://www.bluestar-forensic.com/gb/hexagon.php). Este é um teste feito em duas partes: Um tubo de recolha de sangue e uma barra de teste (cassete).

1º - Recolheu-se de uma porção de sangue

2º - Aplicaram-se duas gotas da solução na "cassete"

3º - Aguardou-se até 10min para ver os resultados

Comparação de resultados entre manchas diferentes

1 - sangue animal

2 - sangue animal

3 - sangue humano

Relativamente à análise do envelope suspeito, foi necessário determinar se se tratava de saliva humana ou animal - Rapid Stain Identification (RSID).

1º - Retirou-se uma pequena porção da amostra e coloca-se num tubo de 1,5ml

2º - Adicionou-se um tampão de extracção

3º - Deixou-se a incubar durante 1h para que as células epiteliais fiquem em suspensão

4º - Noutro eppendorf, misturou-se uma pequena porção da solução inicial com tampão de corrida

5º - Apliciou-se a solução obtida na "cassete"

6º - Aguardou-se 10min para ver os resultados

Seguiu-se o mesmo procedimento relativamente à análise da saliva da Marta.

Comparação de resultados

Marta - positivo para saliva humana

Suspeito - positivo para saliva humana

Uma vez confirmado, prossegui-se para a extracção do DNA, com o objectivo de obtermos perfis de DNA. Para tal, são necessários os seguintes passos:

1º - Extracção

2º - Quantificação

3º - PCR

4º - Electroforese em gel de agarose

- EXTRACÇÃO

Neste processo, primeiramente, retira-se uma pequena porção da amostra em estudo à qual são adicionadas as soluções correspondentes a cada um dos métodos.

Existem dois métodos de extracção de DNA :

1) Método de Chelex

Soluções utilizadas:

- Solução de Chelex 5%

Tem um pH alcalino

Ajuda na libertação do DNA do núcleo

Recorreu-se à centrifugação, thermomixer e a um banho em ebulição.

Armazenou-se a -20ºC até à utilização em PCR

2) Fenol-clorofórmio

Soluções utilizadas:

- Solução tampão DLB

Ressuspende as células

Quela os catiões bivalentes para que não degradem o DNA

- Solução SDS

Detergente que promove a ruptura das membranas celulares, permitindo a libertação do DNA para a solução

- Proteinase K

Enzima que degrada proteínas

Promove a libertação do DNA a elas associadas

Segue-se um período de incubação nocturo até à sua próxima utilização.

Eles ainda estão à solta, mas não por muito tempo...

Apresentação

Olá,
Somos um grupo de três alunas do secundário seleccionadas para frequentar um estágio na Universidade de Aveiro sobre a genética na investigação do crime.
Assim sendo, através deste blogue, vamos dar a conhecer, o trabalho que se vai desenvolver nestes 5 dias.

O grande desafio será obter um perfil de DNA a partir de vestigios (calças de ganga manchadas e um envelope "suspeito") encontrados no local do crime.


Acompanhem-nos na nossa investigação...

Flávia Sequeira, Joana Cantante e Marta Casaca